Ann Rutherford est née à Vancouver, en Colombie-Britannique, au Canada. Fille de John Rutherford, ancien chanteur du Metropolitan Opera, et de Lillian Mansfield, actrice, Ann était prédestinée au monde du spectacle. Peu après sa naissance, sa famille s'installe en Californie, où elle fait ses débuts sur scène en 1925.
Ann joue dans de nombreuses pièces de théâtre et participe à des émissions de radio pendant les neuf années suivantes avant d'apparaître pour la première fois au cinéma dans « Waterfront Lady » (1935). Son talent est évident et elle signe pour trois films en 1935 : « Waterfront Lady », « Melody Trail » et « The Fighting Marines ». Elle est alors une vedette des westerns mythiques, aux côtés de deux légendes : John Wayne et Gene Autry.
À 17 ans, Ann signe un contrat avec la MGM, où elle accède au statut de superstar grâce à son interprétation de Polly Benedict dans la populaire série « Andy Hardy » avec Mickey Rooney. Le premier rôle d'Ann, celui de Polly, remonte à 1938, dans « You're Only Young Once » (1937). Trois autres films des Hardy Hardy furent produits la même année : « Out West with the Hardys » (1938), « Love Finds Andy Hardy » (1938) et « Judge Hardy's Children » (1938). Ann trouva également le temps de jouer dans d'autres productions. L'une d'entre elles, toujours appréciée aujourd'hui, est le classique de Charles Dickens, « A Christmas Carol » (1938), dans lequel elle interpréta le rôle touchant de l'Esprit des Noëls passés.
En 1939, Ann incarna Annie Hawks dans « Of Human Hearts » (1938), en plus de trois autres films des Andy Hardy. Mais cette même année, elle décrocha un rôle dans le film le plus populaire de l'histoire du cinéma. Elle interpréta Careen O'Hara, la petite sœur de Scarlett, dans « Gone with the Wind » (1939). De nombreux fans des Andy Hardy allèrent voir le film rien que pour Ann. Le film fut incontestablement un immense succès. Ann reprit ensuite le tournage d'autres films.
Pendant son contrat avec la MGM, Ann, comme les autres vedettes, était sous l'œil vigilant du magnat du cinéma Louis B. Mayer. Le profit était le seul critère, et Mayer s'efforçait de minimiser les salaires des acteurs. La plupart tentèrent d'obtenir une augmentation, en vain. Même Mickey Rooney fut nettement sous-payé durant ses années de gloire à la MGM. Mais pas Ann Rutherford. Lorsqu'elle demanda une augmentation, elle sortit son chéquier et, lui montrant le montant qu'il contenait, expliqua à Mayer qu'elle avait promis une nouvelle maison à sa mère. Ann obtint son augmentation.
En 1942, à l'âge de 22 ans, Ann apparut dans son dernier film avec Andy Hardy, « Andy Hardy's Double Life » (1942). Elle quitta ensuite la MGM et travailla comme actrice indépendante. Ann était toujours très demandée. En 1943, elle joua dans « Happy Land » (1943), mais ce n'est que plus tard dans sa carrière qu'elle connut deux grands succès. En 1947, elle interpréta Gertrude Griswold dans La Vie rêvée de Walter Mitty, puis Donna Elena dans Les Aventures de Don Juan en 1948.
Son dernier rôle fut en 1976 dans le navet Won Ton Ton : Le Chien qui a sauvé Hollywood, après quoi elle prit sa retraite. On lui proposa d'incarner Rose âgée dans le blockbuster Titanic (1997), mais elle refusa le rôle. Elle profita pleinement de sa retraite, comblée de courrier de fans et multipliant les interviews et les apparitions publiques.
